lunes, 29 de abril de 2013

Práctica 18. Biomoléculas





Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
Campus Puebla


Práctica No. 18
 Biomoléculas

Responsable: Mtro. Víctor Hugo Blanco Lozano

Equipo No. 8
Grupo 2


Integrantes del equipo:
Stephania Díaz Lorenzo                    A00397831
Ana Laura Velázquez Gil                   A01325205
Omar Sánchez Jiménez                    A01324800
Jorge Armando Luna Morales           A01099726
Gabriela Rivera Hernández               A01325193


Objetivos:
A lo largo de la práctica se realizarán múltiples reacciones químicas y pruebas esenciales, que caracterizan la presencia de diferentes biomoléculas en una mezcla o producto específico. Asimismo, también será necesario aprender a cuantificar las mismas para su posterior análisis y observación de datos y resultados.

Introducción:

El carbono y sus compuestos son fabricados constantemente por múltiples organismos vivos, y se encuentran divididos en cuatro grandes grupos: carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Todos ellos difieren tanto es sus propiedades químicas, como en las físicas; sin embargo, los tres primeros son similares metabólicamente, al menos, en el hecho de que son fuente de energía para los organismos, dado a que el rompimiento de moléculas complejas da como resultado liberación de energía. De esta manera los componentes de las moléculas orgánicas se pueden usar en una gran variedad de combinaciones en los organismos vivos. A estos componentes se les conoce como biomoléculas, y están presentes en la mayoría de los procesos biológicos de los organismos. (Universidad Nacional de Colombia, 2013)

A lo largo de la práctica, se trabajará con distintos compuestos así como con múltiples pruebas metódicas con el fin de identificar las biomoléculas que se hallan presentes en los productos adyacentes en cuestión. Dichas pruebas son desglosadas en la sección de Desarrollo para tener una mayor visión del trabajo experimental realizado durante las tres horas de laboratorio. No obstante, se mencionará un poco acerca de las pruebas más características para la identificación de glúcidos.
Para la identificación de glúcidos con poder reductor dentro de los monosacáridos y disacáridos, se trabajó primordialmente con dos pruebas, conocidas como Fehling y Benedict.

Las pruebas de Fehling y Benedict se basan en la capacidad de los azúcares reductores de reducir los iones cúpricos (Cu2+). Tanto la solución de Fehling como la de Benedict son soluciones alcalinas de Cu2+ complejado con iones tartrato (Fehling) o citrato (Benedict). Si un fluido analizado contiene un azúcar reductor, el ion cúprico se reduce al estado cuproso (Cu2O). Esta reducción del cobre se manifiesta en la desaparición del color azul oscura de la solución reactivo y en la aparición de un precipitado rojo.
(Bradley, F., & Bennett, T. P., 1982)

Consideraciones Teóricas

Las biomoleculas son las moléculas constituyentes de los seres vivos. Los cuatro bioelementos más abundantes en los seres vivos son el carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, representando alrededor del 99% de la masa de la mayoría de las células

Diferencias entre azúcares reductores y no reductores

El azúcar, un carbohidrato cristalino, comestible y soluble en agua, es esencial para la producción de energía en todos los seres vivos. Aunque se asocia más comúnmente con la sacarosa que se encuentra en los alimentos de sabor dulce, el azúcar también se encuentra en la mayoría de las frutas (fructosa) y en casi todos los aperitivos, alimentos procesados o bebidas con sabor como el jarabe de maíz de alta fructosa. A nivel químico, un azúcar se considera "reductora" si reduce un agente oxidante dentro de una reacción química, mientras que las que no reducen la oxidación se llaman "no reductoras".

Componentes químicos

Los azúcares con estructuras químicas que incluyen un átomo de carbono anomérico libre (tal como glucosa, maltosa, lactosa y fructosa) utilizan este extremo libre para reducir el oxígeno en una reacción química mediante la donación de electrones a la otra (unión) molécula. Otros azúcares (tales como sacarosa) han cerrado estructuras químicas, donde los átomos abiertos son utilizados para unir a la estructura en su conjunto y, por lo tanto, no tienen los electrones libres para donar a la molécula de unión. Debido a esto, la oxidación no se reduce durante la reacción.

Tipos de azúcares reductores

Todos los monosacáridos (azúcares simples que no pueden descomponerse en moléculas más pequeñas) son azúcares reductores. Dos de los tres tipos de azúcares disacáridos (con dos anillos de sustancias químicas), maltosa y lactosa, tienen la estructura química abierta necesaria para actuar como agentes reductores. La estructura simple de los monosacáridos les permite romperse dos veces tan rápidamente como los disacáridos, mientras que los disacáridos se rompen en sus partes más pequeñas primero.

Tipos de azúcares no reductores

El tercer tipo de disacáridos, sacarosa, y polisacáridos (azúcares con anillos químicas múltiples) son los azúcares no reductores. Los polisacáridos - almidones - tienen estructuras cerradas, que utilizan átomos libres para unir entre sí los anillos múltiples, y tardan mucho más tiempo en descomponerse.

Desarrollo:

EXPERIMENTO I. Reconocimiento de glúcidos

MATERIALES Y REACTIVOS
- Tubos de ensayo
- Gradilla
- Pinzas
- Mechero
- Pipetas
-Solución de Lugol
- Solución de Fehling A y B
- Solución alcalina (sosa, potasa, bicarbonato, etc.)
- HCl diluido
- Soluciones al 5% de glucosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa y almidón.

Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de manifiesto por medio de una reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la citada reacción y que, por lo tanto, el glúcido presente es reductor.

Prueba de Fehling

. Poner en los tubos de ensayo 3ml de la solución de glucosa, maltosa, lactosa fructosa o sacarosa (según indique el profesor).
. Añadir 1ml de solución de Fehling A (contiene CuSO4) y 1ml de Fehling B (lleva NaOH para alcalinizar el medio y permitir la reacción)
. Calentar los tubos a la llama del mechero hasta que hiervan.
. La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo y será negativa si queda azul o cambia a un tono azul-verdoso.
. Observar y anotar los resultados de los diferentes grupos de prácticas con las distintas muestras de glúcidos que se le proporcionaran.



R= 2.5 ml de maltosa, sacarosa, glucosa, fructuosa y almidón.

La solución de Fehling ya se encontraba preparada,  se usó maltosa, sacarosa, glucosa y fructuosa los resultados fueron:

Solución
Color
Resultado
Maltosa
Cambió de color azul a rojo
Positivo
Sacarosa
No cambió de color, permaneció en azul
Negativo
Glucosa
Cambió de color azul a rojo
Positivo
Fructuosa
Cambió de color azul a rojo
Positivo

Prueba de Tollens

Coloque en un tubo de ensayo limpio 1 ml de solución de nitrato de plata al 2.5%, agregue una gota de hidróxido de sodio al 5% y después gota a gota y con agitación una solución de hidróxido de amonio al 5% justo hasta que se disuelva el óxido de plata que precipitó, evitando cualquier exceso de NH4OH. Este reactivo debe usarse recién preparado y debe destruirse con un exceso de ácido nítrico al terminar de utilizarlo, ya que forma compuestos explosivos.

Agregue al reactivo recién preparado 5 a 10 gotas de solución de azúcar, agite y caliente brevemente en baño maría, sin dejar de agitar durante el calentamiento. La aparición de un espejo de plata indica prueba positiva para azúcar reductor. Una vez terminada la prueba el tubo de ensaye se deberá limpiar con ácido nítrico para destruir el espejo de plata.

Esta prueba fue realizada en la sesión #16 de laboratorio, el reactivo de trollens fue preparado con anterioridad por el maestro a cargo, los reactivos que fueron utilizados para esta prueba fueron
·         Sacarosa
·         Glucosa
·         Fructuosa
·         Lactosa
·         Maltosa

*Debido a una posible contaminación en los reactivos estos no mostraron los resultados esperados, ya que el espejo de plata apareció en 4 de ellos(sacarosa, glucosa, fructosa y lactosa) cuando solamente debía a aparecer en 2 (glucosa y sacarosa).




Prueba de Benedict

Coloque en un tubo de ensaye 1 ml del reactivo de Benedict y cuatro o cinco gotas de la solución del azúcar. Caliente a ebullición y deje enfriar a temperatura ambiente. Un precipitado cuya coloración varía desde amarillo hasta rojo, con decoloración de la solución, indica prueba positiva.

Solución
Observaciones
Fructuosa
Después de calentarse se tono de un color rojo en la parte inferior, en medio azul y en la parte superior de un tono naranja.
Maltosa
En la parte inferior apareció un color rojizo menos profundo que el de la fructuosa pero abarcaba más volumen del tubo de ensayo, se muestra azul en la parte intermedia y en la parte superior se observa un color anaranjado más claro que el de la fructuosa.
Sacarosa
Continuo de color azul
Glucosa
Tiene una mancha roja al fondo, seguida de una azul y en la parte superior una de color naranja.

Anote los resultados en el siguiente cuadro:


Reacción de Trollens
Reacción de Fehling

Reacción de Benedict
Glucosa
Formación de espejo de plata
Cambió de color azul a rojo. Positivo
Tiene una mancha roja al fondo, seguida de una azul y en la parte superior una de color naranja
Fructuosa
Formación de espejo de plata
Cambió de color azul a rojo. Positivo
Después de calentarse se tono de un color rojo en la parte inferior, en medio azul y en la parte superior de un tono naranja.
Maltosa
No se formó el espejo de plata
Cambió de color azul a rojo. Positivo
En la parte inferior apareció un color rojizo menos profundo que el de la fructuosa pero abarcaba más volumen del tubo de ensayo, se muestra azul en la parte intermedia y en la parte superior se observa un color anaranjado más claro que el de la fructuosa.
Sacarosa
Formación de espejo de plata
No cambió de color, permaneció en azul. Negativo
Continuo de color azul

La sacarosa es un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres por lo que carece de poder reductor y la reacción con el reactivo de Fehling es negativa, tal y como ha quedado demostrado en el experimento 1.
Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza, es decir, incorpora una molécula de agua y se descompone en los monosacáridos que la forman, glucosa y fructosa, que sí son reductores. La prueba de que se ha verificado la hidrólisis se realiza con el reactivo de Fehling y, si el resultado es positivo, aparecerá un precipitado rojo. Si el resultado es negativo, la hidrólisis no se ha realizado correctamente y si en el resultado final aparece una coloración verde en el tubo de ensayo se debe a una hidrólisis parcial de la sacarosa.

TÉCNICA

. Tomar 3ml de solución de sacarosa y añadir 10 gotas de HCl diluido.
. Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos.
. Dejar enfriar.
. Neutralizar añadiendo 3ml de solución alcalina.
. Realizar la prueba de Fehling como se indica en el experimento 1.
. Observar y anotar los resultados

El color de la sacarosa paso de ser azul a ser un color verde ligeramente rojizo, lo que nos indica que hubo una hidrolisis parcial.

INVESTIGACIÓN DE POLISACÁRIDOS (ALMIDÓN)

FUNDAMENTO

El almidón es un polisacárido vegetal formado por dos componentes: la amilosa y la amilopectina. La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una reacción química sino a la adsorción o fijación de yodo en la superficie de la molécula de amilosa, lo cual sólo ocurre en frío. Como reactivo se usa una solución denominada lugol que contiene yodo y yoduro potásico.
Como los polisacáridos no tienen poder reductor, la reacción de Fehling da negativa.

TÉCNICA
. Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solución de almidón.
. Añadir 3 gotas de la solución de lugol.
. Observar y anotar los resultados.
. Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.
. Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el color azul.

Se colocaron 3 ml de solución de almidón al 5%  en un tubo de ensayo y posteriormente se le añadieron 3 gotas de solución Lugol, la solución se tornó de un color café oscuro en el fondo y en la superficie se observó un color aún más oscuro, se calentó sin que se dejase hervir hasta que el color se perdió, después de enfrió el tubo con agua del grifo y después de aproximadamente 4 min la solución de torno azul nuevamente.

EXPERIEMENTO II. Extracción de ADN

MATERIAL Y REACTIVOS

·         Mortero con pistilo
·         Colador o centrífuga
·         Vaso de precipitado de 100 mL
·         Tubo de ensayo grande
·         Varilla fina o asa de Henlle
·         Matras erlemeyer 125 Ml
·         Muestra vegetal (fresa, zarzamora, hijo, plátano, tomate. jitomate)
·         1 Kilogramo de Hielo
·         Agua (destilada o mineral)
·         Cloruro de sodio
·         Bicarbonato sódico
·         Detergente líquido
·         Alcohol etílico 90 %

FUNDAMENTO

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN.
En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al
ADN, de gran longitud, se habrá fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol etílico.

REALIZACIÓN

1. Preparar el tampón o solución de lisis con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado:

·         50 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo.
·         1,5 g cloruro de sodio
·         5 g de bicarbonato sódico.
·         5 ml de detergente líquido.

2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos, y molerla en el mortero con pistilo. Triturar la muestra con un poco de agua
3. Mezclar en un matraz de 125 mL limpio 10 ml del triturado celular con 20 ml del tampón frío y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.
4. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol etílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.

5.  Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su estreno con el aspecto de un copo de algodón mojado.

Se molieron en el mortero 3 fresas con un poco de agua y se tomaron 10 ml, luego se colocó dentro del matraz de 125 ml junto con 20ml de la  solución de lisis  que anteriormente había sido preparado,  se agitó durante 2 minutos, se hizo pasar por un papel filtro para quitar los pedazos de mayor tamaño, al liquido molecular obtenido se le quitaron 5ml  y se pusieron en un tubo de ensayo, al tubo de ensayo se le agregó posteriormente 10ml de alcohol etílico, el alcohol quedó en la parte superior del recipiente sin mezclarse con la solución de lisis, se introdijo la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y la solución de lisis,  se removió la varilla, pasando un minuto la varrilla se retiró atravesando la capa de alcohol, el ADN quedó adherido, su aspecto es una especie de algodón o espuma.

El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.




Cuestionario:

¿Cuál es la función del detergente en el experimento? Explique y esquematice la acción
Se ocupó el detergente ya que este realiza la acción de lisar o bien romper las células que se va a extraer. el detergente hace que la célula vacíe su contenido molecular en una disolución en la cual se va a disolver el DNA.


¿Cuál es la función química del cloruro de sodio en el experimento?
El cloruro de sodio hace que el proceso de la extracción sea posible pues facilita el propósito de la deshidratación que realiza el alcohol y así mismo facilita la separación por medio de la centrifugación.
¿Cuál es la función del alcohol en el experimento?
El alcohol se utiliza para extraer el DNA debido a que la solución contiene además de DNA otras moléculas como proteínas, RNA, carbohidratos etc., se necesita sacar únicamente el DNA y el alcohol limpia el DNA haciendo que se deshidrate y lo aísla para dejarlo libre de impurezas.
Al finalizar la experiencia se obtiene un mucus blanco y fibroso que sería el ADN. ¿Es posible que la molécula de ADN se visualice a simple vista? ¿Por qué? ¿Y qué creen que contiene "el ADN" obtenido en la experiencia?
No es posible ya que además de el tamaño tiene pegados algunos fragmentos de RNA y el DNA obtenido no es del todo puro.
CUESTIONARIO
1 ¿Por qué en la saponificación la glicerina aparece en la fase acuosa?
La glicerina aparece en la fase acuosa debido a que las grasas se descomponen gracias a que sucede un mecanismo de hidrólisis mediante las enzimas lipasas, el hecho de que se lleve a cabo la hidrólisis es lo que provoca que el producto de la descomposición de las grasas en este caso la glicerina aparezca en la fase acuosa.  
2. ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas?

La enzima que logra esto en el aparato es la lipasa, esta enzima da a lugar la formación de ácidos grasos y glicerina. 

3. Indica lo que ocurre con la mezcla aceite-Sudán III y explica

Debido a que el Sudán III es un colorante que es sumamente soluble en las grasas hace que la mezcla tome un color rojizo. Por lo tanto esto significa que hace posible la detección de la presencia  de grasas en una mezcla determinada.(Díaz, 2011)
CUESTIONARIO
1.    ¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de las proteínas?

El proceso de desnaturalización en las proteínas se manifiesta de forma que aparece un proceso llamado coagulación, el cual consiste en que las proteínas al ser calentadas a temperaturas de alrededor de mas de 70 grados Celsius  o al agregarse soluciones salinas, ácidos o alcohol forman coágulos y esto destruye sus estructuras tanto secundaria como terciaria.

2.     ¿Cuál de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización?
El agente desnaturalizante mas potente es el ácido sulfúrico ya que debido a que es un ácido muy fuerte, es capaz de hacer que la proteína tenga una mayor pérdida de la estructura.
3.     ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína?

Si en un caso determinado esta proteína sería un lípido se puede hacer uso de algún ácido para poder desnaturalizarla y se identificarían viendo si se forman grumos en la mezcla. Posteriormente se podría llevar a cabo la reacción del biuret adicionando este reactivo y observando la coloración.(Ávila, 2009)

4.    ¿Qué coloración da la reacción del Biuret?

la coloración de la reacción del Biuret al haber proteínas es violeta y cuando hay combinación con polipéptidos da un color rosa.

5.     ¿Una proteína coagulada podría dar la reacción del Biuret?

Si es posible realizar la reacción del Biuret con una proteína desnaturalizada ya que esta al desnaturalizarse pierde su estructura secundaria y terciaria pero conserva la estructura primaria por lo que los enlaces peptídicos siguen ahí y la reacción podrá cumplir su objetivo.


6.     Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es positiva o negativa? ¿Por qué?
Cuando realizamos esta reacción en un aminoácido dará negativa ya que esta reacción se encarga de detectar la presencia de proteínas y otros compuestos que cuentan con enlaces peptídicos, estos enlaces deberán ser dos o mas, si se tiene un solo aminoácido no existe tal enlace. Sin embargo si se tienen dos daría positiva.(Ávila,2009)

Conclusión:

 A lo largo de la práctica se trabajó con distintas pruebas y metodologías con el fin de identificar la presencia de diversas biomoléculas dentro de los productos en cuestión. Dentro de dichas pruebas, figuran las más características, como lo son Fehling, Benedict, y Tollens para el reconocimiento de glúcidos, extracción de ADN, la técnica de saponificación para el reconocimiento de lípidos y reacciones de Biuret para la coagulación de proteínas, así como la prueba de Xantoproteínas.

Todo el procedimiento llevado a cabo permitió el análisis y comprensión de los resultados obtenidos mediante conocimientos afianzados en las materias de Química I y Química Orgánica, dando  como resultado una mayor valoración de los mismos.


Referencias:

Universidad Nacional de Colombia. BIOMOLÉCULAS (Componentes químicos de la Célula). Recuperado el 28 de abril de 2013, de:
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000024/lecciones/cap01/01_01_00.htm

Bradley, F., & Bennett, T. P. (1982). Glúcidos. Bioquímica (p. 163). Madrid, España : Editorial Reverté S.A. .

Ávila M. 2009. Proteínas. BIOQUIMICA 1.Rescatado de
http://es.scribd.com/doc/16208396/Informe-de-laboratorio-4-Bioquimica

Díaz L. 2011. 18 de marzo. Reconocimiento de lípidos. Rescatado de
http://diazpintolauraproyecto.blogspot.mx/2011/03/trabajo-de-grupo-de-proyecto-integrado.html


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